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KI小鼠模型構(gòu)建

KI小鼠模型構(gòu)建

簡(jiǎn)要描述:
KI小鼠模型構(gòu)建:基因敲入(Knock-in, KI)小鼠通過(guò)在基因組特定位點(diǎn)精準(zhǔn)插入外源序列(如報(bào)告基因、人類(lèi)疾病突變或條件性表達(dá)元件),是研究基因功能調(diào)控、人類(lèi)疾病模擬和藥物測(cè)試的核心工具

更新時(shí)間:2025-06-26

訪問(wèn)量:34

廠商性質(zhì):其他

一、KI小鼠模型構(gòu)建技術(shù)路線選擇

方法

周期

插入片段限制

適用場(chǎng)景

CRISPR-HDR

2-4個(gè)月

<5 kb

快速構(gòu)建短片段KI(如點(diǎn)突變、FLAG標(biāo)簽)

ES細(xì)胞同源重組

6-12個(gè)月

無(wú)限制

大片段插入(如Cre重組酶、人源化基因)

CRISPR-轉(zhuǎn)座子/病毒

3-5個(gè)月

10-50 kb

超大片段插入(如BAC轉(zhuǎn)基因替代)




二、KI小鼠模型構(gòu)建CRISPR-HDR方案(短片段插入推薦)

1. 靶點(diǎn)設(shè)計(jì)與供體制備

  • gRNA設(shè)計(jì)

    • 靶向插入位點(diǎn)(避開(kāi)功能域),使用CHOPCHOP優(yōu)化效率。

  • 供體DNA設(shè)計(jì)

5'同源臂 60-100nt

目標(biāo)序列+篩選標(biāo)記*

3'同源臂 60-100nt

    • 化學(xué)修飾ssODN(單鏈)需3'硫代磷酸酯化,dsDNA(雙鏈)需磷酸化。

    • 沉默突變:在gRNA靶區(qū)引入1-2 bp突變防止重切(必需?。?。

2. 受精卵注射

  • 注射混合物

    • Cas9蛋白 (50 ng/μL) + gRNA (25 ng/μL) +       ssODN/dsDNA (100 ng/μL)。

  • 胚胎移植

    • 移植20-30個(gè)注射后胚胎至假孕母鼠。

3. 基因型鑒定

  • PCR策略

    • 外側(cè)引物(同源臂外)內(nèi)側(cè)引物(插入序列內(nèi))僅陽(yáng)性鼠能擴(kuò)增。

    • 測(cè)序驗(yàn)證:確保插入序列無(wú)indel突變。

4. 品系建立

  • F0嵌合體:與野生型交配,篩選生殖系傳遞后代(通常50%概率)。




三、ES細(xì)胞同源重組方案(大片段KI

1. 靶向載體構(gòu)建

5'同源臂 1.5-3kb

目標(biāo)序列

FRT-flanked NeoR

3'同源臂 1.5-3kb

DTA負(fù)選標(biāo)記

  • 關(guān)鍵元件

    • 同源臂:長(zhǎng)度與插入片段正相關(guān)(>5 kb插入需≥3 kb同源臂)。

    • 篩選標(biāo)記NeoR(后續(xù)可通過(guò)Flp刪除)。

2. ES細(xì)胞操作

  • 電轉(zhuǎn)與篩選

    • G418NeoR)篩選10-14天,Pick 200-300個(gè)克隆。

  • 陽(yáng)性克隆驗(yàn)證

    • 長(zhǎng)片段PCR(覆蓋整個(gè)插入?yún)^(qū)域)。

    • Southern blot:確認(rèn)單拷貝整合。

3. 小鼠制備

  • 囊胚注射:將陽(yáng)性ES細(xì)胞注入C57BL/6N囊胚。

  • 傳代:嵌合體與Flp deleter小鼠交配刪除NeoR。




四、條件性KIcKI)附加設(shè)計(jì)

1. loxP系統(tǒng)

  • 策略:在目標(biāo)基因前插入loxP-stop-loxPLSL)結(jié)構(gòu),與Cre小鼠交配后激活表達(dá)。

  • 應(yīng)用

    • 報(bào)告基因Rosa26-LSL-tdTomato

    • 致癌基因Kras-LSL-G12D。

2. 誘導(dǎo)型系統(tǒng)

  • Tet-OnrtTA + TRE-目標(biāo)基因,需多xi環(huán)素誘導(dǎo)。




五、經(jīng)典KI模型案例

插入類(lèi)型

應(yīng)用

代表模型

點(diǎn)突變

模擬人類(lèi)遺傳病(如APP突變)

APP-KI(阿爾茨海默?。?/p>

報(bào)告基因

細(xì)胞譜系追蹤

Rosa26-CAG-LSL-GFP

人源化基因

藥物測(cè)試

hCYP3A4-KI(代謝研究)




六、關(guān)鍵優(yōu)化策略

  1. 提高HDR效率

    • 添加HDR增強(qiáng)劑(如Rad51 mRNARS-1)。

    • 使用Cas9變體(如Cas9-D10A nickase)。

  2. 減少隨機(jī)整合

    • 線性化供體DNA(避免質(zhì)粒骨架整合)。

  3. 表型驗(yàn)證

    • mRNA水平qPCR檢測(cè)插入基因表達(dá)。

    • 蛋白水平:抗體檢測(cè)(如HA/FLAG標(biāo)簽)。

 


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