流式實驗應(yīng)用中，除了常見的表面抗原染色，還會進(jìn)行胞內(nèi)因子檢測，比如：常見的細(xì)胞因子：IFN、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF；核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子：FOXP3、GATA3、STAT5；胞內(nèi)信號通路相關(guān)蛋白：MAPK家族 (AKT、P38、JNK、ERK) 等。胞內(nèi)染色步驟相對復(fù)雜，涉及的變異因素多，很容易出現(xiàn)結(jié)果不穩(wěn)定、較難重復(fù)等問題。
 

　　一般情況下，靜息狀態(tài)的T、B細(xì)胞不產(chǎn)生或極低產(chǎn)生細(xì)胞因子，多數(shù)細(xì)胞因子必須在T細(xì)胞激活后才能分泌產(chǎn)生，所以必須采用體外激活來刺激細(xì)胞因子的表達(dá)。流式胞內(nèi)染色中*常用的活化方法就是使用一定濃度的廣泛性刺激劑：PMA (佛波酯) 和lonomycin (離子霉素)，刺激細(xì)胞4-6 h (可優(yōu)化)。
 

　　PMA和lonomycin刺激細(xì)胞活化的機制：在細(xì)胞內(nèi)，Protein kinase C(PKC) 的激活，可以引起下游眾多蛋白激酶的磷酸化，形成級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致多種蛋白的表達(dá)引起細(xì)胞的活化。PKC可以在DAG (二酯酰甘油) 和Calcium (Ca2+) 的共同作用下被激活，PMA是一種DAG的模擬物，lonomycin 是Ca2+的轉(zhuǎn)運劑，可將細(xì)胞器內(nèi)的Ca2+ 轉(zhuǎn)運到胞漿，所以PMA和lonomycin的共同作用可以激活PKC，從而引起一系列的下游反應(yīng)。
 

　　刺激后的細(xì)胞不能直接進(jìn)行流式檢測，細(xì)胞因子會分泌到胞外影響實驗結(jié)果，還需要加入阻斷劑，將細(xì)胞因子阻斷在胞內(nèi)，有助于細(xì)胞因子的聚集使胞內(nèi)染色信號增強，提高檢出率，所以這一步至關(guān)重要。常用的阻斷劑有兩種：1. Monensin (莫能霉素)；2. Brefeldin A (BFA，布雷非德菌素a)。
 

　　Monensin是一種離子載體(ionophore)，可選擇性結(jié)合單價陽離子如：Li+、Na+、K+、Rb+、Ag+和Tl+，并把這些陽離子轉(zhuǎn)運到細(xì)胞膜內(nèi)，破壞跨膜離子梯度；BFA是一種真菌代謝物，可以干擾囊泡自粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)至高爾基體的轉(zhuǎn)運。這兩種阻斷劑的區(qū)別：Monensin的阻斷作用在高爾基體轉(zhuǎn)運到胞外，BFA的阻斷作用在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運到高爾基體。