活體光學(xué)成像(Optical in vivo Imaging)主要采用生物發(fā)光(bioluminescence)技術(shù)與熒光(fluorescence)技術(shù)。生物發(fā)光是用熒光素酶(Luciferase)基因標(biāo)記細(xì)胞或DNA，今天，生物發(fā)光標(biāo)記物可以標(biāo)記到任何一種基因上，使對基因功能的全面細(xì)致研究成為現(xiàn)實。而熒光技術(shù)則采用熒光報告基團(tuán)(GFP、RFP，Cyt及dyes等)進(jìn)行標(biāo)記，利用熒光蛋白在外源光源或是內(nèi)源發(fā)光照射下被激發(fā)產(chǎn)生的熒光作為檢測信號。研究人員能夠利用一套非常靈敏的光學(xué)檢測儀器直接監(jiān)控活體生物體內(nèi)的細(xì)胞活動和基因行為。
該技術(shù)可被廣泛應(yīng)用于標(biāo)記細(xì)胞或基因的示蹤及檢測；基因治療(gene therapy)在活體動物體內(nèi)直接的觀察和檢測；基因組、蛋白組學(xué)、藥學(xué)及生物技術(shù)在活體動物內(nèi)的研究；藥物及化學(xué)合成藥物的藥物代謝及毒理學(xué)監(jiān)測；食品菌落生長成像；皮膚醫(yī)學(xué)中皮膚疾病的體內(nèi)成像；法醫(yī)鑒定；微孔板成像，例如：免疫分析、報告基因、基因探針和嗜菌作用分析等；熒光團(tuán)的體內(nèi)成像，例如：Alzheimer疾病研究中結(jié)合嗪的β-淀粉沉淀物分析；轉(zhuǎn)基因植物(transgenic plant)中通過報告基因?qū)ι碇芷诠?jié)奏的研究；凝膠成像分析等等。
實驗步驟
1. 用熒光色素DiD標(biāo)記間充質(zhì)干細(xì)胞
1) 先用*消化待標(biāo)記材料，使之成為一定密度的懸浮液；
2) 從細(xì)胞培養(yǎng)箱中取出間充質(zhì)干細(xì)胞，吸取含原有培養(yǎng)基的細(xì)胞懸浮液進(jìn)行標(biāo)記；
3) 用10 ml Mg/Ca-free PBS (不含鈣鎂離子的磷酸緩沖液)清洗細(xì)胞，吸去PBS，鈣鎂離子會影響*的活性，必須小心；
4) 加入預(yù)熱的0.05% *液，加液量以T75型瓶為例，每瓶加5ml，確保瓶的表面被*覆蓋；
5) 在細(xì)胞培養(yǎng)箱中37° C 孵育約 5 分鐘；
6) 然后在顯微鏡下確認(rèn)細(xì)胞已經(jīng)*分散，如果有細(xì)胞貼壁情況，輕拍若干次或延長孵育時間直至酶解消化*成功；
7) 加入等量含 10% FCS的培養(yǎng)基中和*；
8) 用移液器反復(fù)吸取幾次確保細(xì)胞均勻分散；
9) 然后移取細(xì)胞懸浮液至15ml 已滅菌的有蓋聚丙烯離心管中；
10) 400 RCF離心5 分鐘；
11) 小心移去上清液，不要擾動細(xì)胞；
12) 將細(xì)胞重新懸浮于DMEM 并進(jìn)行計數(shù)；
13) 需要待標(biāo)記細(xì)胞在無血清DMEM溶液中的密度應(yīng)為1x106/ml ；
14) 每ml細(xì)胞懸浮液加入5 μL DiD 染色液；
15) 用移液器將染色液與細(xì)胞懸浮液混合均勻；
16) 在6孔低附著性細(xì)胞板上37°C 孵育20分鐘；
17) 孵育*后移取細(xì)胞懸浮液至15ml 已滅菌的有蓋聚丙烯離心管中；
18) 400 RCF離心5 分鐘；
19) 小心移去染色液，不要擾動細(xì)胞；
20) 用PBS清洗細(xì)胞，用移液器反復(fù)吸取幾次確保細(xì)胞均勻分散；
21) 重復(fù)洗三次；
22) 細(xì)胞重新計數(shù)并用臺盼藍(lán)染色法檢測細(xì)胞活性；
23) 進(jìn)行活細(xì)胞成像。
2. 用熒光色素ICG標(biāo)記人胚胎干細(xì)胞
1) 必須先準(zhǔn)備好*溶液(血容量、心輸出量、肝功能測定劑)作為對照品，然后使之與轉(zhuǎn)染試劑*(抗凝血作用)混合；
2) 測出1ml*溶液的活力，然后在100 μL DMSO中溶解ICG；
3) 向混合物中加入 400 μL Dulbecco的改良Eagles 培養(yǎng)基 (DMEM加10% 胎牛血清)，震蕩均勻，*溶液終濃度為2mg/ml；
4) 加入轉(zhuǎn)染試劑*，*作為對照品的載體，使之能夠有效進(jìn)入細(xì)胞；
5) 在300 μL ICG 和 300 μL 無血清Dulbecco改良 Eagles 培養(yǎng)基中混入 5 μL 硫酸*溶液，使之終濃度為 10mg/ml，；
6) 震蕩5分鐘使之形成復(fù)合物，標(biāo)記溶液制備完畢；
7) 從 hESC 10mm Petri 培養(yǎng)皿中移去原有培養(yǎng)基；
8) 加入5ml預(yù)熱的 DMEM；
9) 加入制備好的*/ICG 溶液， 37°C下孵育1h；
10) 孵育*后移去染色液；
11) 用5 ml PBS漂洗培養(yǎng)皿以清除染色液；
12) 移去 PBS 再加入 5ml 0.25 % *液，37°C下孵育5分鐘使之酶解，適當(dāng)震搖培養(yǎng)皿效果會更好；
13) 用移液器反復(fù)吸取幾次確保細(xì)胞均勻分散；
14) 加入等量含 10% KSR的培養(yǎng)基中和*；
15) 然后移取細(xì)胞懸浮液至15ml 已滅菌的有蓋聚丙烯離心管中，400 RCF離心5 分鐘；
16) 在全培養(yǎng)基中懸浮細(xì)胞；
17) 如果還有細(xì)胞團(tuán)塊，可以移去原有培養(yǎng)基用10ml預(yù)熱的全ESC培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞，重復(fù)酶解再離心；
18) 在這一點上，鼠源飼喂細(xì)胞需從hESCs中分離；
19) 然后將細(xì)胞懸浮液移至涂布瓊脂的10 cm 培養(yǎng)皿中；
20) 37°C 孵育 45 分鐘，注意不要晃動培養(yǎng)皿，如此鼠源飼喂細(xì)胞會貼壁而干細(xì)胞保持懸??；
21) 從Petri 培養(yǎng)皿中移出已標(biāo)記的單細(xì)胞人胚胎干細(xì)胞懸浮液；
22) 細(xì)胞重新計數(shù)并用臺盼藍(lán)染色法檢測細(xì)胞活性；
23) 進(jìn)行活細(xì)胞成像。
