在制藥過程中，細菌內(nèi)毒素的檢測依賴于鱟血資源。隨著注射劑、疫苗類、化學(xué)藥品類等制劑品的需求不斷增長，鱟血資源的使用率越來越高；同時，鱟試劑中含有B因子、C因子、G因子、凝固酶原，存在由1,3-β-D-葡聚糖激活G因子導(dǎo)致的假陽性結(jié)果。所以，建立一套不依賴鱟生物進行細菌內(nèi)毒素檢測的快捷、高效的補充替代方法尤為重要。

作為新型的重組鱟試劑檢測方法：PSNG、rFC則備受關(guān)注。

一、PSNG和rFC的概念

01 PSNG

PSNG（基因重組鱟試劑）是一種基因工程技術(shù)合成的細菌內(nèi)毒素定量檢測試劑，該試劑不依賴鱟血資源，滿足可持續(xù)發(fā)展的目標。

它完-全模擬了天然鱟試劑LAL的酶聯(lián)反應(yīng)，包含C因子、B因子、凝固酶原，是唯-一一種擁有與傳統(tǒng)鱟試劑相同酶聯(lián)反應(yīng),同時又消除了與1,3-β-D-葡聚糖交叉反應(yīng)造成假陽性結(jié)果的內(nèi)毒素檢測試劑。

PSNG（上圖右側(cè)）成功去除了天然鱟試劑（上圖左側(cè)）的G因子干擾。

02 rFC

重組C因子法（rFC）是通過體外重組鱟凝血級聯(lián)反應(yīng)的第一個組分：C因子，激活的C因子直接剪切一個熒光底物，產(chǎn)生的信號被熒光酶標儀識別。相較于傳統(tǒng)的動態(tài)LAL法，重組C因子法只有一種反應(yīng)機制。

反應(yīng)機制：左側(cè)為基因重組鱟試劑 右側(cè)為重組C因子試劑

二、LAL、PSNG、rFC對比情況

作為新型的重組鱟試劑PSNG、rFC，與傳統(tǒng)的鱟試劑LAL進行細菌內(nèi)毒素檢測時又會有什么不同呢？

01 PSNG與LAL在檢測內(nèi)毒素上比較

（圖1）

由圖1所示，通過研究在顯色底物存在下，使用三種重組酶原的多種組合，確定三種重組酶原是否能重建反應(yīng)步驟。

結(jié)果證實，當(dāng)三種重組酶原同時存在時，內(nèi)毒素才能激活蛋白酶活性，得出了PSNG與LAL在檢測內(nèi)毒素上具有等效性。另外，研究證實了，三種重組酶原的蛋白酶活性大大增強，信號放大。

02 LAL、PSNG、rFC對內(nèi)毒素敏感度比較

（圖2）

從反應(yīng)機制上看，rFC缺少了級聯(lián)放大的兩個環(huán)節(jié)（加速反應(yīng)），只能通過熒光檢測人為放大（減少了來源于自然反應(yīng)的特異性）。

如圖2所示，凝-血-酶的活化是LAL信號放大的主要驅(qū)動力；B因子的活化是針對內(nèi)毒素的特異性活化，由此可以得出，PSNG（rCR）敏感度比rFC更高。

03 PSNG與LAL檢測時間比較

（圖3）

如圖3所示，通過對一系列濃度RSE（細菌內(nèi)毒素參考標準品）應(yīng)用PyroSmart NextGen™（PSNG）和典型動態(tài)顯色試劑檢測得到的起始時間值，得出PyroSmart NextGen™較典型的動態(tài)顯色試劑檢測縮短了大約一半的時間。

04 PSNG與LAL批間一致性比較

（圖4）

天然來源的LAL試劑具有固定的批次間變異性，而PyroSmart NextGen™試劑表現(xiàn)出批次間的一致性。圖4所示，六個單獨批次的PyroSmart NextGen™試劑的曲線標準趨于一致，證明PSNG具有重復(fù)性和可預(yù)測性的性能。

05 PSNG與LAL對內(nèi)毒素特異性比較

（圖5）

圖5的X-Y軸分別表示的是加標/不加標1,3-β-D葡聚糖的各批次PyroSmart NextGen™和系列標準濃度的反應(yīng)。結(jié)果顯示了添加1,3-β-D葡聚糖對應(yīng)用PyroSmart NextGen™對內(nèi)毒素的檢測不存在干擾，各批次間相關(guān)性良好。

06 PSNG驗證性能

（圖6）

（圖7）

如圖6、圖7所示，應(yīng)用PyroSmart NextGen™在50-0.005 EU/mL內(nèi)毒素范圍內(nèi)，在兩批次、四個分析人員、三天內(nèi)條件下，執(zhí)行了24個性能驗證實驗。依據(jù)ICH Q2指南標準，結(jié)果顯示各驗證參數(shù)滿足標準要求。

07 PSNG、rFC、LAL針對檢測樣品的比較

（圖8）

（圖9）

（圖10）

圖8、圖9、圖10所示，適合性/一致性研究測試了多個成品、水、緩沖液等樣品，得出PyroSmart NextGen™較 LAL具有相等或較低的不干擾稀釋倍數(shù)(NID)。另外，Muroi 等人報告了使用PyroSmart NextGen™前身 PyroSmart 試劑檢測藥典118種腸外注射藥物得出了相似的結(jié)果。

基于以上數(shù)據(jù)得出結(jié)論，重組鱟試劑方法(rCR)適合于廣泛的產(chǎn)品檢測。可比性研究測試了多種來源的細菌內(nèi)毒素和水樣，證實應(yīng)用PyroSmart NextGen™檢測具有較好的相對回收率。

08 PSNG、LAL、rFC方法對比

（圖11）

如圖11 所示，PSNG優(yōu)于重組C因子法。PSNG檢測過程不需要更換方法和設(shè)備，就能繼續(xù)同樣的工作流程。

三、總結(jié)

從LAL、PSNG、rFC對比情況來看，PyroSmart NextGen™較rFC、LAL在細菌內(nèi)毒素檢測上具有較強的優(yōu)勢：

相比重組C因子內(nèi)毒素檢測方法，PyroSmart NextGen™內(nèi)毒素檢測試劑可以產(chǎn)生級聯(lián)放大反應(yīng)，使得內(nèi)毒素檢測更加高效和靈敏。