【小貝離心Protocol】超速離心方法制備無(wú)外泌體血清
以外泌體為代表的細(xì)胞外囊泡是近幾年研究的熱點(diǎn)，目前的外泌體研究主要通過(guò)研究體外培養(yǎng)細(xì)胞來(lái)源的外泌體，分析其在體內(nèi)外的功能作用。一般的血清FBS中含有供體細(xì)胞自然分泌的大量Exosomes，而用于Exosome研究的細(xì)胞必須提前更換無(wú)外泌體的血清進(jìn)行培養(yǎng)，以減少對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的污染。
目前市面上存在著商業(yè)化的無(wú)外泌體血清，然而由于其價(jià)格較高等因素，很多研究者選擇自己制備無(wú)外泌體血清，而常用的主要是基于超速離心的無(wú)外泌體血清分離方法。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，如下圖，使用貝克曼超離自行純化血清，可達(dá)到與商品化無(wú)EV 血清類(lèi)似的效果。
無(wú)外泌體血清制備步驟：
1. 根據(jù)需要處理的血清體積選擇合適的轉(zhuǎn)子與超離管。推薦使用Type 45 Ti轉(zhuǎn)子，一次離心可處理6×94ml。為避免污染，可選用貝克曼無(wú)菌無(wú)酶離心管#C14305，單獨(dú)包裝，即拆即用。
2. 在超凈工作臺(tái)，將普通血清置于超離管中，配平后，進(jìn)行熱封口。
3. 將封口后的超離管放于離心機(jī)Type 45 Ti轉(zhuǎn)子中，并加入相應(yīng)適配器(如果選用#C14305無(wú)菌無(wú)酶離心管，則需要#342697適配器)，然后擰緊轉(zhuǎn)頭蓋。
4. 設(shè)置離心程序：4℃，120,000 ×g，離心18小時(shí)(也有研究者選擇100,000 ×g離心18小時(shí)【2】)。
5. 離心結(jié)束后，回收上清液，為避免污染，在超凈工作臺(tái)操作。
6. 收集得到無(wú)外泌體血清，并儲(chǔ)存于-20℃中備用。
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大 RPM – 45,000
大 RCF - 235,000 x g
k 系數(shù) - 133
離心管數(shù)量/體積/大小/尺寸：
6 x 94 mL
1 ? x 4 in.
38 x 102 mm
轉(zhuǎn)頭容量 - 564 mL
參考文獻(xiàn)
【1】
【2】Tian Y, Gong M, Hu Y, Liu H, Zhang W, Zhang M, Hu X, Aubert D, Zhu S, Wu L, Yan X. Quality and efficiency assessment of six extracellular vesicle isolation methods by nano-flow cytometry. Journal of Extracellular Vesicles. 9: 1697028. PMID 31839906
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