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速率區(qū)帶離心法 |你的分離純化方法選對了嗎？

來源：貝克曼庫爾特商貿(mào)（中國）有限公司 2020年10月28日 15:22

　　密度梯度離心（isodensity centrifugation method）又稱為區(qū)帶離心。

　　該方法的優(yōu)點是可以同時使樣品中幾種或全部組分分離，具有良好的分辨率，分離效果好，可一次獲得較純組分。

　　缺點是離心時間較長，需制備梯度液，操作要求高。

　　按照離心分離原理，密度梯度離心又可分為速率區(qū)帶離心法(rate zonal centrifugation method，R-Z)和等密度離心法 (isopycnic centrifugation method)。

　　速率區(qū)帶離心也可稱為等區(qū)密度離心，是根據(jù)樣品中不同組分粒子所具有的不同的體積大小和不同的沉降系數(shù)將混合樣品進行離心分離提純。

　　離心時將需要分離的樣品溶液置于由密度梯度材料(如蔗糖、氯化銫 (CsCI)、溴化鈉等)形成的梯度液柱上面，樣品粒子的密度必須大于梯度液柱中任一點的密度，否則無法得到理想的區(qū)帶離心效果。離心時，混合樣品中不同的組分將在梯度液柱的不同位置分別形成各自的區(qū)帶，選擇適合的轉(zhuǎn)速和時間進行離心，當各組分區(qū)帶距離拉得遠時，結(jié)束離心，然后將區(qū)帶取出。這樣只需通過一次離心就可以把混合樣品中的各組分分離提純，其純度和回收率均可滿足要求。

　　優(yōu)點是一次分離純化，組分的沉降系數(shù)相差 20% 以上的即可選用此法，分辨力高，操作熟練可以將組分沉降系數(shù)相差 5%～10% 的樣品很好的分離。

　　缺點是材料的條件限制，樣品液濃度不能太高，否則操作條件很難控制，同時此法與差速離心法相比，處理樣品的量要小的多。

圖 1 速率區(qū)帶離心

　　速率區(qū)帶離心的時間必須嚴格控制，不能太短，否則樣品區(qū)帶不清，時間也不能太長，否則待分離組分可能沉底。需要分離的樣品顆粒的沉降速度取決于顆粒形狀、大小、密度及離心力等因素。離心前后樣品的狀態(tài)如圖 1 所示。

　　速率區(qū)帶離心經(jīng)典的應(yīng)用就是通過蔗糖密度梯度離心，進行各種亞細胞器(核糖體、線粒體、Exosome 等)和病毒顆粒(病毒載體、疫苗等)的純化。例如，我們在上一期中得到的 70S 核糖體沉淀，經(jīng)過水解后，可利用蔗糖密度梯度離心，進一步分離純化得到 50S 和 30S 的兩個亞基。具體的實驗流程如下：

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