EZ Trans細(xì)胞轉(zhuǎn)染液(Ⅱ)產(chǎn)品描述
陽離子聚合物細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑是細(xì)胞轉(zhuǎn)染液(Ⅱ)中的一個(gè)重要分支，除具有轉(zhuǎn)染效率高、適用細(xì)胞范圍廣泛等優(yōu)點(diǎn)外，在體內(nèi)轉(zhuǎn)染還避免了脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑容易導(dǎo)致炎性反應(yīng)或被血清清除的弊端。李記生物開發(fā)的EZ Trans細(xì)胞轉(zhuǎn)染液(Ⅱ)使用新型陽離子聚合物，在保留傳統(tǒng)陽離子聚合物優(yōu)點(diǎn)同時(shí)，有兩個(gè)重要改進(jìn)，一是顯著降低了轉(zhuǎn)染試劑的細(xì)胞毒性；二是顯著提高轉(zhuǎn)染效率，細(xì)胞的適用范圍更廣。經(jīng)比對(duì)試驗(yàn)，在選用的測試細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染效率、細(xì)胞毒性均優(yōu)于大部分市售轉(zhuǎn)染試劑產(chǎn)品，接近或超過Lipo3000。
EZ Trans(Ⅱ)是一種具有較高的陽離子電荷密度的有機(jī)大分子，每相隔二個(gè)碳個(gè)原子都是質(zhì)子化的氨基氮原子，使得聚合物網(wǎng)絡(luò)在任何pH下都能充當(dāng)有效的“質(zhì)子海綿”體。其轉(zhuǎn)染性能好于樹枝狀聚合物，而且它的細(xì)胞毒性低。
EZ Trans細(xì)胞轉(zhuǎn)染液(Ⅱ)使用方法
1. 接種細(xì)胞：用膠原酶消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)（不建議用*）。轉(zhuǎn)染前18-24小時(shí)進(jìn)行細(xì)胞的鋪板，以便在轉(zhuǎn)染時(shí)，貼壁細(xì)胞的密度大約在80%左右。注：培養(yǎng)液中的血清和抗生素不影響轉(zhuǎn)染效率。
2. 準(zhǔn)備 EZ Trans(Ⅱ)-DNA 復(fù)合物
1）轉(zhuǎn)染前將所有試劑置于室溫10分鐘。下面，以轉(zhuǎn)染24孔板培養(yǎng)皿為例，說明轉(zhuǎn)染的具體方法（如果在別的培養(yǎng)器皿中進(jìn)行轉(zhuǎn)染，各試劑建議使用量見表1.：
2）將1 μg 質(zhì)粒DNA稀釋到40 μL無血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，用移液槍吹吸3-4次。
3）將3 μL EZ Trans轉(zhuǎn)染液(Ⅱ)稀釋到40 μL無血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，用移液槍吹吸3-4次。
注：無血清的高糖DMEM培養(yǎng)基是稀釋液，不能使用含血清的培養(yǎng)基進(jìn)行DNA和EZ Trans轉(zhuǎn)染試劑(Ⅱ)的稀釋！因?yàn)镋Z Trans(Ⅱ)-DNA轉(zhuǎn)染復(fù)合物的形成過程不能含有血清。
4）將稀釋好的EZ Trans轉(zhuǎn)染試劑(Ⅱ)一次性全部加入到已稀釋好的質(zhì)粒DNA中，立即用移液槍吹吸3-4次。
注：此混合的順序不能反向進(jìn)行！
5）室溫放置10-15分鐘，以形成EZ Trans(Ⅱ)-DNA復(fù)合物。
表1：不同培養(yǎng)體積對(duì)應(yīng)的待轉(zhuǎn)DNA、EZ Trans(Ⅱ)、稀釋液用量
培養(yǎng)器皿 | 培養(yǎng)液體積（mL） | DNA量（μg） | EZ Trans(Ⅱ) (μL) | 稀釋液(μL) |
48孔板 | 0.3 | 0.5 | 1.5 | 2 × 25 |
24孔板 | 0.5 | 1 | 3 | 2 × 40 |
12孔板 | 0.75 | 1.5 | 4.5 | 2 × 60 |
6孔板 | 1 | 3 | 9 | 2 × 125 |
35 mm培養(yǎng)皿 | 1 | 3 | 9 | 2 × 125 |
60 mm 培養(yǎng)皿 | 3 | 6 | 18 | 2 × 250 |
100 mm 培養(yǎng)皿 | 9 | 12 | 36 | 2 × 500 |
3. 轉(zhuǎn)染細(xì)胞
1）將上述80μL EZ Trans(Ⅱ)-DNA轉(zhuǎn)染復(fù)合物均勻滴入到含細(xì)胞的培養(yǎng)皿中。輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)皿或輕微渦旋，讓EZ Trans(Ⅱ)-DNA復(fù)合物分散均勻。
2）在 CO2培養(yǎng)箱中 37℃下孵育細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后12-18小時(shí)，去除含EZ Trans(Ⅱ)-DNA復(fù)合物的培養(yǎng)液。（若細(xì)胞形態(tài)欠佳，可在轉(zhuǎn)染3-5h后，添加1/2體積的包含30%血清的生長培養(yǎng)基，在轉(zhuǎn)染12-18小時(shí)后*去除含EZ Trans(Ⅱ)-DNA復(fù)合物的培養(yǎng)液，用含血清和抗生素的新鮮培養(yǎng)液。）
3）轉(zhuǎn)染后快7h即可檢測到轉(zhuǎn)入基因的表達(dá)，可根據(jù)需要在24-48小時(shí)內(nèi)檢測轉(zhuǎn)染效率。
注：篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，可在上述操作后（轉(zhuǎn)染細(xì)胞24小時(shí)后），將細(xì)胞傳代至新鮮的生長培養(yǎng)基中（將細(xì)胞稀釋10倍以上），在CO2培養(yǎng)箱中 37℃孵育過夜。在有轉(zhuǎn)染抗性基因相匹配的藥物篩選條件下，約 1～2周可篩選到耐藥性克隆，在這期間需經(jīng)常更換含篩選藥物的生長培養(yǎng)基。
EZ Trans細(xì)胞轉(zhuǎn)染液(Ⅱ)運(yùn)輸與保存方法
常溫運(yùn)輸，4℃保存，保質(zhì)期12個(gè)月。
使用注意事項(xiàng)
質(zhì)粒質(zhì)量：請(qǐng)務(wù)必使用高質(zhì)量轉(zhuǎn)染級(jí)無內(nèi)毒素質(zhì)粒。通過260 nm光吸收測定DNA 濃度，260nm / 280nm比值確定 DNA 純度（比值應(yīng)該在1.8～2.0的范圍之內(nèi)）。如有可能，請(qǐng)通過瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)粒的完整性。
細(xì)胞條件：使用適當(dāng)保存和經(jīng)常傳代的健康細(xì)胞。確保培養(yǎng)基沒有被細(xì)菌、真菌或支原體污染。如果細(xì)胞是近期復(fù)蘇的液氮凍存細(xì)胞，請(qǐng)?jiān)谵D(zhuǎn)染前至少傳代兩次。建議使用GIBCO或者李記生物的胎牛血清培養(yǎng)細(xì)胞。
特別提醒
1. 對(duì)于某些類型的細(xì)胞如 HEK-293、HEK293T、NIH/3T3 和 COS 細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染前兩天鋪板可顯著提高轉(zhuǎn)入基因的表達(dá)水平。如果選擇轉(zhuǎn)染前兩天鋪板，可適當(dāng)降低鋪板密度，以確保轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞的匯合度仍為70～80%。
2. 對(duì)于接觸抑制敏感的細(xì)胞，可適當(dāng)降低鋪板密度。
3. 即使在有蛋白（如10%的血清）存在的情況下，DNA-EZ Trans(Ⅱ)復(fù)合物仍能轉(zhuǎn)染細(xì)胞，但是DNA-EZ Trans(Ⅱ)復(fù)合物必須在無蛋白存在的條件下形成。
4. 對(duì)大多數(shù)細(xì)胞來而言，每 1μg DNA 使用 3.0μL EZ Trans(Ⅱ)試劑都能獲得較高轉(zhuǎn)染效率。使用者也可嘗試每 1μg DNA使用 1～4μL體積線性EZ Trans轉(zhuǎn)染試劑(Ⅱ)進(jìn)行優(yōu)化。
EZ Trans(Ⅱ)轉(zhuǎn)染液用于不同細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí)用量參考（以96孔板為例）
細(xì)胞型號(hào) | 培養(yǎng)基 | 每孔細(xì)胞數(shù) | DNA的量 | 轉(zhuǎn)染試劑量 |
293H | DMEM | 3×104 | 0.2µg | 0.5µL |
293FT | DMEM | 3×104 | 0.2µg | 0.5µL |
293E | DMEM | 3×104 | 0.2µg | 0.5µL |
293F | DMEM | 3×104 | 0.2µg | 0.5µL |
COS7 | DMEM | 1.5×104 | 0.4µg | 0.5µL |
hela | DMEM | 2×104 | 0.3µg | 0.5µL |
Caco2 | MEM | 3.5×104 | 0.3µg | 0.75µL |
BHK21 | MEM | 2×104 | 0.2µg | 0.5µL |
CHO-DG44 | DMEM+HT+pro | 2×104 | 0.5µg | 0.5µL |
RAW264.7 | DMEM | 3×104 | 0.2µg | 0.5µL |
MCF7 | MEM/NEAA+0.01mg/mL insulin + sodium pyruvat | 2×104 | 0.1µg | 0.25µL |
SW480 | IMDM | 3×104 | 0.4µg | 0.5µL |
MDCK | DMEM | 4×104 | 0.6µg | 1µL |
CHO-K1 | IMDM+Pro | 3×104 | 0.2µg | 0.5µL |
HepG2 | DMEM | 3×104 | 0.5µg | 0.75µL |
A549 | DMEM | 2×104 | 0.3µg | 0.5µL |
NIH/3T3 | DMEM | 1.5×104 | 0.1µg | 0.75µL |
vero | DMEM | 3×104 | 0.3µg | 0.75µL |
sf9 | SIM SF | 5×104 | 0.4µg | 0.75µL |
附：幾種細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法比較
轉(zhuǎn)染方法 | 原理 | 主要應(yīng)用 | 特點(diǎn) |
陽離子聚合物
（EZ Trans(Ⅱ)） | 帶正電的聚合物與核酸帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)形成帶正電的復(fù)合物后與細(xì)胞表面帶負(fù)電的蛋白多糖相互作用，并通過胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞。 | 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 所有細(xì)胞 | 除了具有陽離子脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染效率高，操作簡單，適用范圍廣，重復(fù)性好等特點(diǎn)外，還具有在體內(nèi)，轉(zhuǎn)染效率高，細(xì)胞毒性低等特點(diǎn)，是新一代的轉(zhuǎn)染試劑。 |
陽離子脂質(zhì)體法 | 帶正電的脂質(zhì)體與核酸帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)形成復(fù)合物，然后脂質(zhì)體上剩余的電核與細(xì)胞膜上的唾液酸殘基的負(fù)電核結(jié)合；另一種解釋是通過細(xì)胞是內(nèi)吞作用而被進(jìn)入細(xì)胞。(若DNA濃度過高，中和脂質(zhì)體表面電核，而降低了與細(xì)胞的結(jié)合能力) | 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 所有細(xì)胞 | 使用方法簡單，可攜帶大片段DNA，通用于各種類型的裸露DNA或RNA，能轉(zhuǎn)染各種類型的細(xì)胞，沒有免疫原性。雖在體外基因轉(zhuǎn)染 中有很高的效率，但在體內(nèi)，能被血清清除，并在肺組織內(nèi)累積，誘發(fā)強(qiáng)烈的抗炎反應(yīng)，導(dǎo)致高水平的毒性，這在很大程度上限制了 其應(yīng)用 |
DEAE-葡聚糖法 | 帶正電的DEAE-葡聚糖與核酸帶負(fù)電的磷酸骨架相互作用形成的復(fù)合物被細(xì)胞內(nèi)吞 | 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 | 相對(duì)簡便、重復(fù)比磷酸鈣好,但對(duì)細(xì)胞有一定的毒副作用,轉(zhuǎn)染時(shí)需除血清且一般只用于BSC-1,CV-1,COS 細(xì)胞系 |
磷酸鈣法 | 磷酸鈣DNA復(fù)合物吸附細(xì)胞膜被細(xì)胞內(nèi)吞 | 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 染瞬轉(zhuǎn)染 | 不適用于原代細(xì)胞（所需的DNA濃度較高）,操作簡便但重復(fù)性差,有些細(xì)胞不適用細(xì)胞建議用CSCL梯度離心，轉(zhuǎn)染是拷貝數(shù)較多 |
逆轉(zhuǎn)錄病毒(RNA) | 通過病毒中膜糖蛋白和宿主細(xì)胞表面的受體相互作用而進(jìn)入宿主細(xì)胞，之后反轉(zhuǎn)入酶啟動(dòng)合成DNA并隨機(jī)整合到宿主基因組中 | 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 特定宿主細(xì)胞 | 可用于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞、原代細(xì)胞，體內(nèi)細(xì)胞等,但攜帶基因不能太大（<8kb）, 細(xì)胞需處分裂期,需考慮安全因素 |
腺病毒 (雙鏈 DNA) | 先和細(xì)胞表面的受體結(jié)合，繼而在αv整合素介導(dǎo)下被細(xì)胞內(nèi)吞 | 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 特定宿主細(xì)胞 | 可用于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞,需考慮安全因素 |
Biolistic顆粒傳遞法 （基因槍粒子轟擊法） | 將DNA用顯微重金屬顆粒沉淀，再將包被好的顆粒用彈道裝置投射入細(xì)胞，DNA在胞內(nèi)逐步釋放，表達(dá) | 瞬時(shí)性轉(zhuǎn)染 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 | 可用于：人的表皮細(xì)胞， 纖維原細(xì)胞，淋巴細(xì)胞系以及原代細(xì)胞 |
顯微注射法 | 用顯微操作將 DNA直接注入靶 細(xì)胞核 | 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 | 轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)有限,多用于工程改造或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的胚胎細(xì)胞 |
電穿孔法 | 高脈沖電壓破壞細(xì)胞膜電位，DNA通過膜上形成的小孔導(dǎo)入 | 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 所有細(xì)胞 | 適用性廣，除了質(zhì)粒外，還可轉(zhuǎn)染大的基因組 （>65kb）但細(xì)胞致死率高， DNA和細(xì)胞用量大， 需根據(jù)不同細(xì)胞類型優(yōu)化電穿孔實(shí)驗(yàn)條件，拷貝數(shù)較少1-20 |
